پیٹر سارنو کے ذریعہ ترمیم شدہ، اسٹینفورڈ یونیورسٹی اسکول آف میڈیسن، اسٹینفورڈ یونیورسٹی، کیلیفورنیا، 25 دسمبر 2020 کو منظور ہوا (25 اکتوبر 2020 کو جائزہ لیا گیا)
ہم کورونا وائرس-ٹرانسکرپشن کمپلیکس کی نقل میں ذیلی یونٹس کے درمیان تعامل کی اطلاع دیتے ہیں، جو نقل اور ارتقائی تحفظ کے لیے ضروری ہیں۔ہم نے اس بات کا ثبوت فراہم کیا کہ nsp12 کے ساتھ وابستہ NiRAN ڈومین میں ٹرانس میں نیوکلیوسائیڈ مونو فاسفیٹ (NMP) کی منتقلی کی سرگرمی ہے، اور اس کے ہدف کے طور پر nsp9 (ایک RNA بائنڈنگ پروٹین) کی نشاندہی کی ہے۔NiRAN ایک رد عمل میں NMP moiety کے محفوظ nsp9 امینو ٹرمینس کے ہم آہنگ اٹیچمنٹ کو متحرک کرتا ہے جو Mn2+ آئنوں اور ملحقہ محفوظ Asn باقیات پر انحصار کرتا ہے۔یہ پایا گیا کہ NiRAN سرگرمی اور nsp9 NMPylation کورونا وائرس کی نقل کے لیے ضروری ہیں۔ڈیٹا ہمیں نیسٹڈ وائرس اینزائم مارکر کی اس سرگرمی کو اس مفروضے میں پچھلے مشاہدات سے جوڑنے کی اجازت دیتا ہے کہ آر این اے وائرس کی ایک کلاس میں آر این اے کی ترکیب کا آغاز فعال اور ارتقائی طور پر مطابقت رکھتا ہے۔
Nidovirales (Coronaviridae، Arterioviridae، اور 12 دیگر خاندانوں) کا RNA پر منحصر RNA پولیمریز (RdRps) پولی پروٹین سے خارج ہونے والے غیر ساختی پروٹین (nsp) میں امینو ٹرمینل (N-terminal) ڈومین سے منسلک ہے، جسے NiRAN کہتے ہیں۔ 1ab وائرل مین پروٹیز (Mpro) پر مشتمل ہے۔اس سے پہلے، آرٹیریل وائرس NiRAN-RdRp nsp کی اپنی GMPylation/UMPylation سرگرمی کی اطلاع دی گئی تھی، اور یہ تجویز کیا گیا تھا کہ نیوکلیوسائیڈ مونو فاسفیٹ (NMP) کی منتقلی کے لیے (فی الحال نامعلوم) وائرس اور/یا سیل بائیو پولیمرائزیشن چیزوں میں ایک عارضی پیدا کریں۔یہاں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ کورونا وائرس (ہیومن کورونا وائرس [HCoV]-229E اور Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) میں Mn2+ پر منحصر NMPylation سرگرمی ہے، جو nsp9 سے Mpro-mediated nsp9 کی تشکیل کے ذریعے حاصل کی گئی ہے۔ این ٹرمینل فلانکنگ این ایس ایس پی کو پروٹولیٹک طور پر جاری کیا جاتا ہے، فاسفورامیڈیٹ کو این ایس پی 9 کے این ٹرمینل پر پرائمری امائن (N3825) سے جوڑا جاتا ہے۔اس رد عمل میں یوریڈین ٹرائی فاسفیٹ ترجیحی نیوکلیوٹائڈ ہے، لیکن اڈینوسین ٹرائی فاسفیٹ، گانوسین ٹرائی فاسفیٹ، اور سائٹائڈائن ٹرائی فاسفیٹ بھی موزوں ذیلی ذیلی جگہیں ہیں۔ریکومبیننٹ کورونا وائرس nsp9 اور nsp12 پروٹینز اور جینیاتی طور پر انجنیئرڈ HCoV-229E اتپریورتنوں کا استعمال کرتے ہوئے اتپریورتن کے مطالعے نے NiRAN کی ثالثی nsp9 NMPylation اور سیل کلچر میں وائرس کی نقل کے لیے ضروری باقیات کا تعین کیا۔ڈیٹا نے NiRAN فعال سائٹ کے باقیات کی پیشین گوئی کی تصدیق کی اور nsp9 NMPylation اور وٹرو میں وائرس کی نقل میں nsp9 N3826 باقیات کے اہم کردار کا تعین کیا۔یہ باقیات محفوظ شدہ N-ٹرمینل NNE ٹریپپٹائڈ ترتیب کا حصہ ہے اور یہ ثابت ہوا کہ nsp9 کی واحد غیر متغیر باقیات اور کورونا وائرس فیملی میں اس کے ہومولوگس ہیں۔یہ مطالعہ دوسرے نیسٹڈ وائرسز کی NMPylation سرگرمی کے فعال مطالعہ کے لیے ایک ٹھوس بنیاد فراہم کرتا ہے اور اینٹی وائرل ادویات کی نشوونما کے لیے ممکنہ اہداف تجویز کرتا ہے۔
Nidovirales مثبت پھنسے ہوئے آر این اے وائرس مختلف قسم کے کشیرکا اور غیر فقرے کو متاثر کرتا ہے (1، 2)۔آرڈر میں فی الحال 14 خاندان (3) شامل ہیں، جن میں سے گزشتہ 20 سالوں میں کورونا وائرس کے خاندان کا بڑے پیمانے پر مطالعہ کیا گیا ہے۔اس وقت، جانوروں کے میزبانوں سے تین زونوٹک کورونا وائرس ابھرے اور انسانوں میں سانس کے شدید انفیکشن کے بڑے پیمانے پر پھیلنے کا سبب بنے۔شدید شدید متعدی بیماریوں کی وجہ سے مسلسل وبائی امراض بھی شامل ہیں۔سانس لینے کا سنڈروم کورونا وائرس 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7)۔Nidoviruses ایک مشترکہ جینوم تنظیم کا اشتراک کرتے ہیں، اور جھلی سے منسلک ریپلیکیشن-ٹرانسکرپشن کمپلیکس (RTC) کے ذیلی یونٹ کو 5-?²-ٹرمینل دو تہائی اور وائرس کے ذرہ کے بنیادی ساختی ذیلی یونٹ کے ساتھ ساتھ کچھ لوازمات میں انکوڈ کیا جاتا ہے۔ .پروٹین، جینوم کے 3??² آخر تیسرے حصے میں انکوڈ شدہ (1)۔پلانری وائرس (Monoviridae) (8) کے ایک خاندان کے علاوہ، تمام نیسٹڈ وائرس دو بڑے اوپن ریڈنگ فریموں (ORF) ORF1a اور ORF1b میں RTC ذیلی یونٹس کو انکوڈ کرتے ہیں، جن کا ترجمہ جینومک RNA سے کیا جاتا ہے۔ORF1a پولی پروٹین (pp) 1a کو انکوڈ کرتا ہے، اور ORF1a اور ORF1b مشترکہ طور پر pp1ab کو انکوڈ کرتا ہے۔ORF1a کے ذریعے انکوڈ شدہ مین پروٹیز (Mpro) کی عمومی شرکت کے ساتھ، pp1a اور pp1ab دونوں پروٹیلی طور پر مختلف قسم کے غیر ساختی پروٹین (nsps) میں پروسیس ہوتے ہیں، جنہیں 3CLpro بھی کہا جاتا ہے، کیونکہ اس میں picornavirus کے 3Cpro کے ساتھ ہم آہنگی ہوتی ہے۔ 9)۔یہ nsps ایک بڑے متحرک RTC میں جمع ہونے کے بارے میں سوچا جاتا ہے، جینومک RNA (نقل) اور ذیلی جینومک RNA (ٹرانسکرپشن) کی ترکیب کو متحرک کرتا ہے، اور ORF1b (10 فیصد) کے نیچے کی طرف واقع ORF کے اظہار کو مربوط کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ ?12)۔
بنیادی RTC میں RNA پر منحصر RNA پولیمریز (RdRp) (13)، سپر فیملی 1 ہیلیکیس (HEL1) (14, 15) اور کئی RNA پروسیسنگ انزائمز شامل ہیں، جو بنیادی طور پر ORF1b میں انکوڈ کیے گئے ہیں اور کورونا وائرس فیملی میں اس میں nsp12-nsp16 اور شامل ہیں۔ nsp9-nsp12 Arterioviridae خاندان میں (حوالہ 10ââ 12 دیکھیں)۔RdRp اور HEL1 پرندوں کے گھونسلے کے وائرس کے دو (ایک پانچواں) محفوظ ڈومینز کی نمائندگی کرتے ہیں اور دوسرے RNA وائرسوں کے درمیان ہم آہنگی رکھتے ہیں۔خیال کیا جاتا ہے کہ کور ریپلیکس کو دیگر ذیلی یونٹس کی مدد حاصل ہے، بشمول pp1a کے کاربوکسی-ٹرمینل (C-ٹرمینل) علاقے سے جاری ہونے والے کئی چھوٹے nsps، Mpro کے بہاو (کورونا وائرس nsp5 اور آرٹیریل وائرس nsp4، بالترتیب)۔ان کے پاس خاندانی مخصوص تحفظ اور متنوع سرگرمیاں ہیں (حوالہ 10-12 میں جائزہ لیا گیا ہے)۔
نسبتاً حال ہی میں، تمام نیسٹڈ وائرسز میں RdRp سے ملحق امینو ٹرمینس (N-terminus) پر منفرد ترتیب موٹف خصوصیات کے ساتھ ایک ڈومین پایا گیا، لیکن کوئی دوسرا RNA وائرس (16) نہیں۔اس کے محل وقوع اور نیوکلیوٹائیڈ ٹرانسفراز (نیوکلیوسائیڈ مونو فاسفیٹ [NMP] ٹرانسفراز) کی سرگرمی کی بنیاد پر، اس ڈومین کا نام NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase) رکھا گیا ہے۔NiRAN-RdRp کا دوہری ڈومین امتزاج Coronaviridae خاندان میں nsp12 اور Arterioviridae خاندان میں nsp9 تشکیل دیتا ہے، اور دیگر nestoviridae میں، NiRAN-RdRp کو وائرل پولی پروٹین سے ایک آزاد این ایس پی کے طور پر جاری کیے جانے کی امید ہے۔کورونا وائرس میں، NiRAN ڈومین 1/450 باقیات پر مشتمل ہے اور لنکر ریجن (16?19) کے ذریعے C-ٹرمینل RdRp ڈومین سے منسلک ہے۔Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae) میں، ریکومبیننٹ nsp9 Mn2+ آئن پر منحصر (خود) UMPylation اور GMPylation سرگرمیاں دکھاتا ہے، جو کہ نیسٹو وائرس، AN، BN اور CN میں تین محفوظ ترتیب کی بنیادوں پر انحصار کرتا ہے جو ترتیب میں موجود باقیات ہیں۔جہاں N کا مطلب ہے NiRAN) (16)۔ان نقشوں کا N-ٹرمینل فلانکنگ ایک کم قدامت پسند شکل preAN ہے۔ان میں سے کچھ اوشیشوں کو دور سے متعلق پروٹین کناسز میں بھی محفوظ کیا گیا ہے، جہاں انہیں نیوکلیوسائیڈ ٹرائی فاسفیٹ (این ٹی پی) بائنڈنگ اور کیٹلیٹک سرگرمی (20، 21) میں ملوث دکھایا گیا ہے۔اس مشاہدے کے مطابق، Pseudomonas syringae سے pseudokinase SelO میں کئی اہم فعال سائٹ کی باقیات کو حال ہی میں شائع شدہ SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 سپر کمپلیکس کے ساتھ جمع کیا جا سکتا ہے۔الیکٹران مائیکرو اسٹرکچر میں محفوظ کورونا وائرس نیران کی باقیات۔ریکومبیننٹ پروٹین (17)۔یہ قیاس کیا جاتا ہے کہ دستاویزی (خود) U/GMPylation NMP کو (موجودہ نامعلوم) سبسٹریٹ (16) میں منتقل کرنے کے لیے ایک عارضی حالت پیدا کرے گا، اور NiRAN اور پروٹین کناز کے درمیان ساختی مماثلت (17, 19) یہ مفروضہ ہے کہ NiRAN دوسرے پروٹینوں میں ترمیم کرتا ہے۔
بہت سی خصوصیات، بشمول نیسٹڈ وائرسز کے ساتھ اس کی منفرد اور منفرد منظم وابستگی اور RdRp سے جینیاتی علیحدگی، NiRAN کو نیسٹڈ وائرسز کے لیے ایک معقول کلیدی ریگولیٹری انزائم بناتی ہے، جو ان کے ظہور اور شناخت کے لیے اہم ہے۔اس سے پہلے، جینوم/سب جینومک ترجمہ یا نقل/ٹرانسکرپشن کو ریگولیٹ کرنے کے لیے NiRAN پر مشتمل تین ممکنہ افعال کو بلایا جاتا تھا۔اس وقت دستیاب قلیل اور نامکمل ڈیٹا پر غور کرتے وقت، ہر فنکشن کے اپنے فوائد اور نقصانات ہوتے ہیں (16)۔اس تحقیق میں، ہمارا مقصد دو نسلوں کی نمائندگی کرنے والے کورونا وائرس کے بائیو کیمیکل اور ریورس جینیٹک اسٹڈیز کو یکجا کرنا ہے، اور اپنے نتائج کو کورونا وائرس فیملی کے فطری اتپریورتن کے ارتقائی پس منظر میں ڈالنا ہے، تاکہ اس پراسرار دائرے کی بصیرت حاصل کی جا سکے۔ہم RTC میں قدرتی اہداف کی شناخت کے ذریعے NiRAN کی تفہیم میں اہم پیشرفت کی اطلاع دیتے ہیں، جو (تین دستیاب مفروضوں میں سے) نیسٹڈ وائرس RNA کی ترکیب شروع کرنے میں اس ڈومین کے کردار میں حصہ ڈالتا ہے۔یہ تحقیق وائرس کے میزبان انٹرفیس پر NiRAN کے دیگر کرداروں کے لیے بھی امکانات کھولتی ہے۔
کورونا وائرس nsp12 سے متعلق NiRAN ڈومین کی انزیمیٹک خصوصیات کو نمایاں کرنے کے لیے، ہم نے E. coli میں انسانی کورونا وائرس 229E (HCoV-229E) nsp12 کی ایک دوبارہ پیدا ہونے والی شکل تیار کی، جس میں C-ٹرمینس پر His6 ٹیگ تھا، اور اس کو ملایا۔ [α32-P] کے ساتھ پروٹین MnCl2 کی موجودگی میں NTP کے ساتھ مل کر انکیوبیٹ کریں جیسا کہ مواد اور طریقوں میں بیان کیا گیا ہے۔رد عمل کی مصنوعات کے تجزیے نے nsp12 (106 kDa) کے ساتھ ہجرت کرنے والے ریڈیو لیبل والے پروٹین کی موجودگی کی نشاندہی کی، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ کورونا وائرس nsp12 ہم آہنگی پروٹین-NMP ایڈیکٹس کی تشکیل کو اتپریرک کرتا ہے، جو ترجیحی طور پر یوریڈین مونو فاسفیٹ (یو ایم پی) کے ساتھ تشکیل پاتا ہے (تصویر 1) ب)۔مقداری تجزیے سے معلوم ہوا کہ دیگر نیوکلیوٹائڈز کے مقابلے میں، UMP کی شمولیت کے سگنل کی شدت میں 2 سے 3 گنا اضافہ ہوا ہے (شکل 1C)۔یہ ڈیٹا کورونا وائرس (16) کے نیران ڈومین کی پیش گوئی شدہ NMP منتقلی کی سرگرمی سے مطابقت رکھتا ہے، لیکن یہ بتاتا ہے کہ کورونا وائرس کے نیران ڈومین اور شریانوں کے وائرس کی نیوکلیوٹائڈ ترجیحات مختلف ہیں۔
HCoV-229E nsp12 کی خود NMPylation سرگرمی۔(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) کو 30 منٹ تک 6 mM MnCl2 کی موجودگی میں نامزد [α-32P] NTP کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا (تفصیلات کے لیے مواد اور طریقے دیکھیں)۔رد عمل کی مصنوعات کو SDS-PAGE کے ذریعے الگ کیا گیا تھا اور Coomassie شاندار نیلے رنگ سے داغے گئے تھے۔(B) ریڈیو لیبل والے پروٹین کو فاسفورس امیجنگ کے ذریعے تصور کیا جاتا ہے۔nsp12-His6 اور پروٹین مالیکیولر ماس مارکر (کلوڈالٹن میں) کی پوزیشنیں A اور B میں دکھائی گئی ہیں۔ (C) تابکار سگنل کی شدت (مطلب ± SEM) کا تعین تین آزاد تجربوں سے کیا گیا تھا۔*P≤0.05۔سگنل کی طاقت (فیصد) UTP سے متعلق ہے۔
اگرچہ NiRAN سے متعلقہ انزائم سرگرمیاں سیل کلچر (16) میں EAV اور SARS-CoV کی نقل کے لیے ضروری دکھائی گئی ہیں، لیکن ابھی تک NiRAN کے مخصوص فنکشن اور ممکنہ اہداف کا تعین نہیں کیا گیا ہے۔نیران اور پروٹین کناز نما فولڈز (17، 22) والے پروٹین کے خاندان کے درمیان حال ہی میں رپورٹ کردہ ساختی مماثلت نے ہمیں اس مفروضے کی جانچ کرنے پر آمادہ کیا کہ NiRAN دوسرے پروٹینوں کے NMPylation کو اتپریرک کرتا ہے۔ہم نے ممکنہ ہم جنس اہداف کا ایک سیٹ تیار کیا، بشمول HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) کے ذریعے انکوڈ شدہ غیر ساختی پروٹین، ہر ایک C-ٹرمینل His6 ٹیگ (SI اپینڈکس، ٹیبل S1) پر مشتمل ہے، اور این ایس پی 12 کی موجودگی یا غیر موجودگی میں ان پروٹینوں کو [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) کے ساتھ انکیوبیٹ کریں۔ای کولی میں پیدا ہونے والے بووائن سیرم البومین اور MBP-LacZα فیوژن پروٹین نے کنٹرول کے طور پر کام کیا (شکل 2A، لین 1 سے 7)۔ریڈیو لیبل والے پروٹین کا تجزیہ سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ-پولیاکریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس (SDS-PAGE) اور آٹوراڈیوگرافی کے ذریعے کیا گیا، اور یہ پایا گیا کہ nsp12 اور nsp9 پر مشتمل رد عمل میں ایک مضبوط تابکار سگنل موجود تھا۔سگنل کی پوزیشن nsp9 کے مالیکیولر ماس کے مساوی ہے، جو nsp9 کے nsp12-ثالثی UMPylation کی نشاندہی کرتی ہے (شکل 2B، ٹریک 7)۔کوئی اور ٹیسٹ پروٹین UMPylated نہیں پایا گیا، جس کی وجہ سے ہم اس نتیجے پر پہنچے کہ nsp9 این ایس پی 12 کا ایک مخصوص سبسٹریٹ ہے۔شکل 1 میں دکھائے گئے خود NMPylation ڈیٹا سے مطابقت رکھتے ہوئے، nsp12 تمام چار NMPs کو nsp9 میں منتقل کرنے کے قابل ہے، اگرچہ کارکردگی مختلف ہے، UMP> اڈینوسین مونو فاسفیٹ (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) تصویر)۔3 اے اور بی)۔اس پرکھ میں استعمال ہونے والی شرائط کے تحت (رد عمل اور نمائش کے وقت کو مختصر کریں، این ایس پی 12 کے ارتکاز کو کم کریں؛ مواد اور طریقے)، این ایس پی 12 کی خود این ایم پییلیشن کا پتہ نہیں چل سکا (شکل 2B، لین 7، اور شکل 1B کا موازنہ کریں)، جو ایک کارآمد ثابت ہوا (اور متعدد راؤنڈز) UMP nsp12 سے nsp9 میں منتقل ہو گیا۔UMP ٹرانسفراز سرگرمی کے لیے Mn2+ آئنوں کی موجودگی کی ضرورت ہوتی ہے، جیسا کہ شکل 3C میں دکھایا گیا ہے، جب کہ Mg2+ کی موجودگی میں صرف کم سے کم UMP ٹرانسفراز سرگرمی دیکھی گئی، اور ٹیسٹ کیے گئے دیگر دو divalent cations کی موجودگی میں کوئی سرگرمی نہیں ہوئی۔اسی طرح کا ڈیٹا NMPylation اسسیس میں حاصل کیا گیا تھا جس میں cytidine triphosphate (CTP)، guanosine triphosphate (GTP)، اور adenosine triphosphate (ATP) (SI اپینڈکس، Figure S1) شامل تھے۔
nsp9 کا HCoV-229E nsp12-ثالثی UMPylation۔پروٹین سبسٹریٹس کی ایک سیریز (بشمول بووائن سیرم البومین، MBP-lacZα، اور HCoV-229E nsps کی ایک سیریز جس پر ORF1a کے ذریعے انکوڈ کردہ C-ٹرمینل His6 کا لیبل لگا ہوا ہے) HCoV-229E nsp12-Histed⁺ کی UMPylation سرگرمی کا جائزہ لینے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ پروٹینجیسا کہ مواد اور طریقوں میں بیان کیا گیا ہے Nsp12 کی غیر موجودگی (A) یا موجودگی (B) میں 10 منٹ تک پروٹین کو [α-32P] UTP کے ساتھ انکیوبیٹ کریں۔A اور B کے اوپری حصے پر، Coomassie Brilliant Blue کے ساتھ داغ دار SDS-polyacrylamide جیل دکھایا گیا ہے، اور A اور B کے نیچے، متعلقہ آٹوراڈیوگرام دکھائے گئے ہیں۔پروٹین مالیکیولر ماس مارکر کی پوزیشن (کلوڈالٹن میں) بائیں طرف دی گئی ہے۔nsp12-His6 (B, top) کی پوزیشن اور nsp9-His6 (B, لین 7) کے ساتھ nsp12-His6 کے انکیوبیشن کے دوران مشاہدہ کیا گیا تابکار سگنل بھی اشارہ کرتا ہے، جو اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ [α-32P] UMP سے nsp9-His6 (12.9 kDa)، جس کا مشاہدہ دوسرے پروٹینوں کے لیے نہیں کیا گیا۔
NSP9 NMPylation کی HCoV-229E NiRAN کی ثالثی کی بائیو کیمیکل اور وائرولوجیکل خصوصیات۔(A اور B) رد عمل میں استعمال ہونے والے نیوکلیوٹائڈ کو سبسٹریٹ کا کردار۔Nsp12-His6 اور nsp9-His6 کو معیاری NMPylation پرکھ میں مختلف [α-32P] NTPs کی موجودگی میں ملایا جاتا ہے اور انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔(A، سب سے اوپر) Coomassie-stained nsp9-His6 SDS-PAGE سے الگ۔(A، نیچے) جیل کے اسی علاقے کا آٹوراڈیوگراف۔(B) نامزد نیوکلیوٹائڈ کوفیکٹر کی موجودگی میں رشتہ دار سرگرمی (مطلب ± SEM) کا تعین تین آزاد تجربوں سے کیا جاتا ہے۔*P≤0.05۔(C) دھاتی آئنوں کا کردار۔[α-32P] UTP اور مختلف دھاتی آئنوں کی موجودگی میں معیاری NMPylation ٹیسٹ دکھایا گیا ہے، ہر ایک کا ارتکاز 1 mM ہے۔C میں، اوپر، Coomassie stained nsp9-His6 دکھایا گیا ہے، اور C میں، نیچے، متعلقہ آٹوراڈیوگرافی دکھائی گئی ہے۔لیبل والے پروٹین کا سائز (کلوڈالٹن میں) A اور C کے بائیں طرف دکھایا گیا ہے۔ (D) HCoV-229E nsp12-His6 کی متغیر شکل جس میں مخصوص امینو ایسڈ کا متبادل ہوتا ہے [α-32P]UTP میں ہے، جیسا کہ بیان کیا گیا ہے۔ مواد اور طریقوں میں.NMPylation رد عمل میں تیار ہونے والے ریڈیو لیبل والے nsp9-His6 کا پتہ فاسفوریلیشن امیجنگ (D، top) سے لگایا جاتا ہے۔جنگلی قسم (wt) پروٹین کے مقابلے میں نسبتا سرگرمی D میں دکھائی گئی ہے، اور نیچے کو تین آزاد تجربے سے اوسط (±SEM) کے طور پر لیا گیا ہے۔ستارے غیر محفوظ شدہ باقیات کے متبادل کی نشاندہی کرتے ہیں۔(E) p1 خلیوں کے کلچر سپرنٹنٹ میں وائرس ٹائٹر انفیکشن کے 24 گھنٹے بعد حاصل کیا گیا تھا جو تختی پرکھ کے ذریعہ طے کیا گیا تھا۔انجینئرڈ HCoV-229E اتپریورتی کے NiRAN ڈومین میں کوڈن کے متبادل کی نشاندہی کی گئی ہے (اوشیشوں کی تعداد pp1ab میں ان کی پوزیشن پر مبنی ہے)۔نقل کی کمی RdRp ایکٹو سائٹ اتپریورتی nsp12_DD4823/4AA کو بطور کنٹرول استعمال کیا گیا تھا۔
NiRAN کی فعال سائٹ کے بارے میں گہری تفہیم حاصل کرنے اور nsp9-specific NMP transferase کی سرگرمی سے متعلق باقیات کا تعین کرنے کے لیے، ہم نے اتپریورتن تجزیہ کیا، جس میں ہم نے NiRAN AN، BN اور CN motifs میں قدامت پسند اوشیشوں کو تبدیل کیا۔ 16) یہ الا ہے (SI اپینڈکس، شکل S2)۔اس کے علاوہ، قدامت پسند Arg-to-Lys یا Lys-to-Arg متبادل کے اثرات کا دو صورتوں میں جائزہ لیا گیا۔ایک (منفی) کنٹرول کے طور پر، وہ باقیات جو کورونا وائرس اور دیگر نیسٹڈ وائرسز کے نیران ڈومین میں محفوظ نہیں ہیں یا اس سے کم محفوظ نہیں ہیں انہیں Ala سے تبدیل کر دیا گیا ہے۔ BN) اور D4280A (CN) nsp12 کے ذریعے nsp9 NMPylation کو نمایاں طور پر کم یا ختم کرتا ہے، جبکہ قدامت پسند متبادل (R4178K)، K4116R) کے ساتھ پروٹین اپنی سرگرمی کا 60% اور 80% برقرار رکھتے ہیں، جو اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ پابندیوں میں نرمی ان کی متعلقہ طرف زنجیریں فزیکو کیمیکل طور پر حساس ہوتی ہیں (شکل 3D)۔کئی دیگر محفوظ شدہ باقیات E4145A, D4273A, F4281A اور D4283A کو تبدیل کرنا بہت کم نقصان دہ ہے، اور nsp9 UMPylation صرف اعتدال سے کم ہوتا ہے۔اسی طرح کے نتائج nsp9 NMPylation رد عمل میں حاصل کیے گئے جن میں دیگر NTPs شامل ہیں (فگر 3D اور SI اپینڈکس، Figure S3)، اس بات کی تصدیق کرتے ہیں کہ مخصوص امینو ایسڈ کے متبادل پر مشاہدہ شدہ اثرات نیوکلیوٹائڈ کو-سبسٹریٹ کی قسم سے آزاد ہیں۔اگلا، ہم نے سیل کلچر میں کورونا وائرس کی نقل پر ان nsp12 متبادلات کے ممکنہ اثرات کا تجربہ کیا۔اس مقصد کے لیے، ہم نے 5 -7 خلیات کو نقل کرنے کے لیے ریکومبیننٹ ویکسینیا وائرس (23، 24) میں کلون کیے گئے مناسب جینیاتی طور پر انجنیئر شدہ تکمیلی DNA (cDNA) ٹیمپلیٹس کا استعمال کیا۔ان خلیوں میں پیدا ہونے والے متعدی وائرس کی نسل کے ٹائٹریشن سے پتہ چلتا ہے کہ زیادہ تر HCoV-229E NiRAN اتپریورتی ممکن نہیں تھے (شکل 3E)۔غیر قابل عمل وائرل اتپریورتیوں کے ایک گروپ میں وہ متبادل شامل ہیں جو وٹرو میں NMP منتقلی کی سرگرمی کو ختم کرنے یا نمایاں طور پر کم کرنے کے لیے دکھائے گئے ہیں (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), لیکن دو دیگر متبادل ہیں (K4116R, E480A) % محفوظ؟ان کی ان وٹرو NMPylation سرگرمی سے پتہ چلتا ہے کہ اضافی پابندیاں شامل ہیں۔اسی طرح، دو دیگر تغیرات (R4178K, F4281A) جو NiRAN کی ان وٹرو NMPylation سرگرمی میں معمولی کمی کا باعث بنے، نے زندہ وائرس پیدا کیے، تاہم، ان وائرسوں نے نقل کے ذریعے ٹائٹرز کو نمایاں طور پر کم کیا۔شکل 3D میں دکھائے گئے ان وٹرو سرگرمی کے اعداد و شمار سے ہم آہنگ، چار دیگر باقیات کی جگہ لے کر جو کورونا وائرس اور/یا دیگر نیسٹڈ وائرسز (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) میں محفوظ نہیں ہیں (8, 16) نے قابل عمل وائرس پیدا کیے، اولاد ہونے کے باوجود جنگلی قسم کے وائرس (شکل 3E) کے مقابلے میں ایک اعتدال سے کم ٹائٹر۔
اس بات کا مطالعہ کرنے کے لیے کہ آیا NiRAN کی ثالثی کی NMP منتقلی کی سرگرمی فعال RdRp ڈومین پر منحصر ہے، RdRp موٹف C میں divalent metal ions (11) کے ہم آہنگی میں شامل دو محفوظ Asp باقیات کو Ala سے تبدیل کر دیا گیا۔ نتیجے میں پروٹین nsp12_DD4823/4AA برقرار رہتا ہے۔ اس کی nsp9 NMPylation سرگرمی، اس بات کی نشاندہی کرتی ہے کہ nsp12 ثالثی ان وٹرو nsp9 NMPylation سرگرمی کے لیے پولیمریز سرگرمی کی ضرورت نہیں ہے (SI ضمیمہ، شکل S4)۔
nsp12 کے لیے nsp9-مخصوص NMP ٹرانسفراز سرگرمی قائم کرنے کے بعد، ہم نے NMP-nsp9 ایڈکٹ کو ماس اسپیکٹومیٹری (MS) کے ذریعے نمایاں کرنے کی کوشش کی۔ریکومبیننٹ HCoV-229E nsp9 کے مکمل پروٹین ماس سپیکٹرم نے 12,045 Da (شکل 4A) کی چوٹی دکھائی۔nsp12 کے اضافے سے nsp9 کے معیار میں کوئی تبدیلی نہیں آئی، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ nsp12 اور nsp9 استعمال شدہ شرائط کے تحت ایک مستحکم کمپلیکس نہیں بنیں گے (ڈینیچریشن) (شکل 4A)۔UTP اور GTP کی موجودگی میں، بالترتیب nsp9 اور nsp12 پر مشتمل ردعمل کی بڑے پیمانے پر پیمائش سے پتہ چلتا ہے کہ UTP کا پروٹین ماس 306 Da منتقل ہوا، اور GTP کا پروٹین ماس 345 Da منتقل ہوا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ ہر nsp9 مالیکیول UMP یا GMP کو باندھتا ہے۔ (تصویر 4) سی اور ڈی)۔یہ قیاس کیا جاتا ہے کہ NiRAN کی ثالثی nsp9 NMPylation کے لیے درکار توانائی NTP ہائیڈولیسس اور پائروفاسفیٹ کی رہائی سے آتی ہے۔اگرچہ اس رد عمل میں nsp12 (انزائم) کے مقابلے nsp9 (ٹارگٹ) کی 10 گنا زیادہ داڑھ کا استعمال کیا گیا تھا، nsp9 کا تقریباً مکمل NMPylation دیکھا گیا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ nsp12 اور nsp9 کے درمیان تعامل قلیل المدتی ہے، اور nsp12 زیادہ NSP9 کو NMPylate کر سکتا ہے۔ وٹرو مالیکیول میں
nsp12 اور UTP یا GTP کی موجودگی میں nsp9 کا سنگل NMPylation۔دکھایا گیا HCoV-229E nsp9 (SI اپینڈکس، ٹیبل S1) (AD) کا مکمل پروٹین ماس سپیکٹرم ہے۔(A) nsp9 اکیلے، (B) nsp9 + nsp12-His6، (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP کی موجودگی میں، (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP کی موجودگی میں۔
nsp12 کے ذریعہ UMPylated nsp9 باقیات کا تعین کرنے کے لئے، nsp9-UMP کو ٹرپسن کے ساتھ کلیو کیا گیا تھا۔نتیجے میں پیپٹائڈس کو نینو ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی (HPLC) کے ذریعے الگ کیا گیا اور ٹینڈم ماس اسپیکٹومیٹری (MS/MS) آن لائن کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔بائیونک سوفٹ ویئر پیکج (پروٹین میٹرکس) کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا کے تجزیے نے N-ٹرمینل امینو ایسڈ کا UMPylation دکھایا۔اس کی تصدیق دستی طور پر ہوتی ہے۔پیشگی پیپٹائڈ کے ٹینڈم ماس سپیکٹرم [UMP]NNEIMPGK (SI اپینڈکس، Figure S5A) نے 421 m/z پر ایک ٹکڑا ظاہر کیا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ UMP nsp9 کے باقیات 1 سے منسلک ہے۔
nsp9 کے N-ٹرمنس پر، Asn کو Orthocoronavirinae (SI اپینڈکس، Figure S6) کے اراکین میں محفوظ کیا جاتا ہے۔اگرچہ ہم سمجھتے ہیں کہ N-ٹرمینل پرائمری امائن نائٹروجن UMP کے لیے ممکنہ طور پر قبول کنندہ ہے، ہم نے N-ٹرمینل پر NMP بائنڈنگ کے اضافی ثبوت حاصل کرنے کا فیصلہ کیا۔اس وجہ سے، HPLC کی طرف سے پیوریفائیڈ غیر NMPylated اور NMPylated N-terminal peptide nsp9 کو ایسیٹون اور سوڈیم سیانوبورہائیڈرائیڈ کی موجودگی میں اخذ کیا گیا تھا۔ان شرائط کے تحت، صرف مفت پرائمری امائنز کو پروپیل (25) کے ساتھ تبدیل کیا جا سکتا ہے۔ترتیب NNEIMPGK کے ساتھ N-ٹرمینل nsp9 سے ماخوذ پیپٹائڈ دو بنیادی امائنز پر مشتمل ہے، ایک Asn کے N-ٹرمینس پر اور دوسرا C-ٹرمنس پر Lys کی سائیڈ چین میں۔لہذا، پروپیل گروپوں کو دونوں سروں پر متعارف کرایا جا سکتا ہے.غیر NMPylated پیپٹائڈس کے نکالے گئے آئن کرومیٹوگرامس کو SI اپینڈکس، شکل S5B میں دکھایا گیا ہے۔جیسا کہ توقع کی گئی ہے، این ٹرمینل اور سی ٹرمینل (مونو) پروپیلیٹڈ (SI اپینڈکس، فگر S5B، اپر لین) اور ڈپروپیلیٹڈ پیپٹائڈس (SI اپینڈکس، فگر S5B، لوئر لین) کی نشاندہی کی جا سکتی ہے۔یہ پیٹرن nsp9 کے NMPylated N-ٹرمینل پیپٹائڈ کے استعمال سے تبدیل ہوتا ہے۔اس صورت میں، صرف سی ٹرمینل پروپیلیٹڈ پیپٹائڈس کی شناخت کی جا سکتی ہے، لیکن این ٹرمینل پروپیلیٹڈ پیپٹائڈس اور ڈپروپیلیٹڈ پیپٹائڈس کی شناخت نہیں کی گئی ہے (SI اپینڈکس، فگر S5C)، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ UMP کو N-ٹرمینل پرائمری امائن میں منتقل کیا گیا ہے تاکہ اسے روکا جا سکے۔ تبدیلیاں کرنے سے گروپ.
اس کے بعد، ہم ہدف کے لیے مخصوص رکاوٹوں کی وضاحت کرنے کے لیے nsp9 کے N-ٹرمینس پر محفوظ شدہ باقیات کو (Ala یا Ser کے ساتھ) تبدیل یا حذف کرتے ہیں۔ہمارے MS ڈیٹا کی بنیاد پر جو یہ ظاہر کرتا ہے کہ NiRAN nsp9 کے N-ٹرمینل باقیات کے بنیادی امائن کے ساتھ ایک nsp9-NMP ایڈکٹ بناتا ہے، ہم نے قیاس کیا کہ nsp9 NMPylation کو وائرل ماسٹر پروٹیز (Mpro, nsp5) کی ضرورت ہوتی ہے تاکہ nsp9 N-ٹرمینل کو جاری کیا جا سکے۔ اس کا پولی پروٹین پیش خیمہ۔اس مفروضے کو جانچنے کے لیے، ہم نے E. coli میں nsp9 پر مشتمل ایک پیشگی پروٹین nsp7-11 تیار کیا اور [α-32P] UTP (مواد اور طریقے) کی موجودگی میں ایک معیاری NMPylation ٹیسٹ کیا۔جیسا کہ شکل 5A (لین 3) میں دکھایا گیا ہے، بغیر کٹے ہوئے nsp7-11 پیشگی کو nsp12 کے ساتھ ریڈیو لیبل نہیں کیا گیا ہے۔اس کے برعکس، اگر nsp7-11 کو nsp9 (اور دیگر nsps) کو پیشگی سے جاری کرنے کے لیے recombinant nsp5 کے ذریعے کلیو کیا جاتا ہے، تو nsp9 کے ساتھ ہجرت کرنے والے ایک ریڈیو لیبل والے پروٹین کا پتہ چل جاتا ہے، جو ہمارے اس نتیجے کی تصدیق کرتا ہے کہ NiRAN اور N- covalent nsp9-NMP اشتھار کی تشکیل .N-ٹرمینل Asn کا ٹرمینل پرائمری امائن (pp1a/pp1ab میں پوزیشن 3825)۔اس نتیجے کو nsp9 تعمیر کا استعمال کرتے ہوئے تجربات سے بھی مدد ملتی ہے، جس میں N-ٹرمینس میں ایک یا دو اضافی باقیات ہوتے ہیں۔دونوں صورتوں میں، nsp9 کی NiRAN ثالثی UMPylation کو ختم کر دیا گیا تھا (SI اپینڈکس، فگر S7)۔اگلا، ہم نے nsp9 کے N-ٹرمینل پر 3825-NNEIMPK-3832 پیپٹائڈ ترتیب سے ایک یا دو Asn باقیات کے ساتھ ایک پروٹین تیار کیا۔دونوں صورتوں میں، nsp9 UMPylation کو مکمل طور پر بلاک کر دیا گیا تھا (شکل 5B)، اضافی ثبوت فراہم کرتا ہے کہ اصلی nsp9 N-terminus NMP ریسیپٹر کے طور پر کام کرتا ہے۔
این ایس پی 9 کی پروٹولوٹک پروسیسنگ اور این ایس پی 12-ثالثی UMPylation میں N-ٹرمینل باقیات کا کردار۔(A) nsp9 UMPylation کے لیے مفت nsp9 N-ٹرمینل کی ضرورت ہے۔Nsp7-11-His6 NMPylation پتہ لگانے والے بفر میں 30 °C پر پہلے سے انکیوبیٹ کیا جاتا ہے جس میں UTP ہوتا ہے ریکومبیننٹ Mpro (nsp5-His6) کی موجودگی یا غیر موجودگی میں۔3 گھنٹے کے بعد، مواد اور طریقوں میں بیان کردہ nsp12-His6 کو شامل کرکے NMPylation پرکھ شروع کریں۔nsp5-His6 (لین 1) اور nsp9-His6 (لین 2) پر مشتمل ردعمل کو بطور کنٹرول استعمال کیا گیا تھا۔10 منٹ کے بعد، رد عمل کو ختم کر دیا گیا اور رد عمل کا مرکب SDS-PAGE کے ذریعے الگ کر دیا گیا۔پروٹین کو کوماسی بریلینٹ بلیو (A، اوپر) سے داغ دیا گیا تھا۔Nsp7-11-His6 کا پیش خیمہ اور nsp5-His6 ثالثی کلیویج کے نتیجے میں پروسیس شدہ پروڈکٹ کو دائیں طرف دکھایا گیا ہے۔براہ کرم نوٹ کریں (ان کے چھوٹے سائز کی وجہ سے) کہ اس جیل میں nsp7 اور nsp11-His6 قابل شناخت نہیں ہیں، اور رد عمل کو nsp5-His6 (لین 1 اور 4؛ nsp5-His6 کی پوزیشن ایک ٹھوس دائرے سے ظاہر ہوتی ہے) کے ساتھ مل جاتی ہے۔ یا nsp9-His6 (لین 2) میں بقایا نجاست کے طور پر MBP کی تھوڑی مقدار (کھلے دائروں سے ظاہر ہوتی ہے) ہوتی ہے کیونکہ ان کا اظہار MBP فیوژن پروٹین (SI اپنڈکس، ٹیبل S1) کے طور پر ہوتا ہے۔(B) Nsp9-His6 ویرینٹ میں ایک یا دو N-ٹرمینل Asn باقیات کی کمی ہے (pp1a/pp1ab میں پوزیشن کے مطابق اوشیشوں کی تعداد) اور اسے nsp12-His6 اور [α-32P] UTP کے ساتھ صاف اور انکیوبیٹ کیا گیا ہے۔B، Coomassie کے ساتھ داغ دار SDS-PAGE اوپر دکھایا گیا ہے، B، متعلقہ آٹوراڈیوگراف نیچے دکھایا گیا ہے۔مالیکیولر ویٹ مارکر کی پوزیشن (کلوڈالٹن میں) بائیں طرف دکھائی گئی ہے۔(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-ٹرمینل محفوظ شدہ اوشیشوں کو Ala یا Ser سے تبدیل کیا گیا تھا، اور nsp12-His6 ثالثی UMPylation رد عمل میں پروٹین کی اتنی ہی مقدار استعمال کی گئی تھی۔رد عمل کی مصنوعات کو SDS-PAGE کے ذریعہ الگ کیا گیا تھا اور Coomassie Brilliant Blue (C، top) سے داغ دیا گیا تھا، اور ریڈیو لیبل والے nsp9-His6 کا پتہ فاسفورسینس امیجنگ (C، مڈل) کے ذریعے کیا گیا تھا۔وائلڈ ٹائپ (wt) پروٹین کو بطور حوالہ استعمال کرتے ہوئے (100% پر سیٹ)، متعلقہ NMPylation سرگرمی (مطلب ± SEM) کا حساب تین آزاد تجربوں سے کیا گیا۔(D) HCoV-229E جنگلی قسم کے Huh-7 خلیوں سے متاثرہ Huh-7 خلیوں کے p1 سیل کلچر سپرنٹنٹ میں وائرس ٹائٹرز، اور nsp9 میں نامزد امینو ایسڈ متبادل لے جانے والے اتپریورتیوں کا تعین تختی پرکھ کے ذریعے کیا گیا تھا۔نقل کی کمی RdRp شکل C ڈبل اتپریورتی DD4823/4AA کو منفی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔
nsp9 کا N-ٹرمینس (خاص طور پر پوزیشنز 1, 2, 3, اور 6) Orthocoronavirinae subfamily (SI اپینڈکس، Figure S6) کے اراکین میں بہت محفوظ ہے۔nsp12-ثالثی nsp9 NMPylation میں ان اوشیشوں کے ممکنہ کردار کا مطالعہ کرنے کے لیے، nsp9 کے N-ٹرمنس پر لگاتار دو Asn باقیات کو Ala یا Ser (تنہا یا مجموعہ میں) سے تبدیل کیا گیا۔جنگلی قسم کے nsp9 کے مقابلے میں، N3825 کو Ala یا Ser سے تبدیل کرنے کے نتیجے میں nsp12-ثالثی UMPylation (شکل 5C) میں دو گنا سے زیادہ کمی واقع ہوئی۔ہمارے اس نتیجے سے مطابقت رکھتے ہوئے کہ NMPylation N-ٹرمینل کی باقیات کی سائیڈ چین کے بجائے N-ٹرمینل پرائمری امائن پر ہوتا ہے، ہم نے N3825A اور N3825S کی تبدیلی کے ساتھ اہم بقایا NMPylation کا مشاہدہ کیا۔دلچسپ بات یہ ہے کہ اگر دوسرے Asn کو Ala یا Ser سے تبدیل کیا جائے تو nsp9 UMPylation زیادہ مضبوطی سے کم ہو جاتا ہے (10 سے زیادہ بار)، جبکہ Ala کی جگہ 3، 4 اور 6 پر nsp9 UMPylation پر صرف ایک معتدل اثر پڑتا ہے (شکل 2) )5C)۔اسی طرح کے نتائج اے ٹی پی، سی ٹی پی یا جی ٹی پی (ایس آئی اپینڈکس، فگر ایس 8) کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیے گئے۔اجتماعی طور پر، یہ اعداد و شمار nsp9 NMPylation میں N2826 (nsp9 میں پوزیشن 2) کے کلیدی کردار کی نشاندہی کرتے ہیں۔
nsp9 اور NMPylation کے N-terminus کے درمیان فنکشنل ارتباط کے اضافی ثبوت حاصل کرنے کے لیے، ہم نے کورونا وائرس فیملی کے nsp9 ترتیب کی ایک سے زیادہ ترتیب کی سیدھ (MSA) انجام دی (104 اور 113 باقیات کے درمیان مختلف) (SI ضمیمہ، شکل S6)۔مجموعی طور پر، Orthocoronavirinae ذیلی خاندان کی 5 نسلوں کی 47 (معروف اور قابل ذکر) پرجاتیوں میں جو مختلف ستنداریوں، پرندوں اور رینگنے والے جانوروں کے میزبانوں کو متاثر کرتی ہیں، مجموعی طور پر صرف 8 باقیات غیر متغیر پائی گئیں۔سب سے زیادہ وسیع تبدیلیاں، بشمول حذف اور اندراج، nsp9 کے ثانوی ڈھانچے کے عناصر کے درمیان چکروں میں دیکھے گئے، جیسا کہ پچھلے ساختی مطالعات (26 ??28) کے ذریعے طے کیا گیا ہے۔این ایس پی 9 کے سی ٹرمینل حصے کے β اسٹرینڈ اور α ہیلکس میں پانچ غیر متزلزل باقیات پائے گئے۔تین غیر متغیر باقیات nsp9 کے N ٹرمینس کا NNE شکل بناتے ہیں۔یہ انکشاف ہوا ہے کہ اس شکل کا دوسرا Asn واحد غیر متزلزل باقیات ہے، جو دور سے متعلق مینڈک کورونا وائرس کے فرضی nsp9 کے ذریعہ بھی اشتراک کیا جاتا ہے، اور Alphaletovirus کی ذیلی فیملی Letovirinae میں Microhyla letovirus 1 کی انواع کی نمائندگی کرتا ہے۔nsp9 ثانوی ساخت کے عناصر میں باقیات کے تحفظ کو فولڈنگ یا معلوم RNA بائنڈنگ خصوصیات کو برقرار رکھنے کے لیے ساختی تحفظات کے ذریعے معقول بنایا جا سکتا ہے۔تاہم، ایسا لگتا ہے کہ یہ استدلال NNE کے تحفظ پر لاگو نہیں ہوتا ہے، اور اس مطالعے سے پہلے، رکاوٹوں کی نوعیت جو ٹریپٹائڈ ترتیب کے تغیر کو محدود کرتی ہے، مکمل طور پر مبہم تھی۔
کورونا وائرس کی نقل میں nsp9-NMPylation اور NNE تحفظ کی اہمیت کا تعین کرنے کے لیے، ہم نے HCoV-229E اتپریورتی تیار کیے، جو nsp9 N-ٹرمینل کی باقیات کے واحد یا دوہری متبادل لے کر آتے ہیں، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ nsp9 NMPylation وٹرو میں نقصان دہ ہے۔اس سے پہلے کہ ہم شروع کریں، ہم اس سوال کا جواب دینے کی کوشش کرتے ہیں کہ آیا یہ متبادل (nsp8|9 کلیویج سائٹ کے قریب) سی-ٹرمینل pp1a خطے کی پروٹولیٹک پروسیسنگ کو متاثر کرتے ہیں۔nsp9 کے N-ٹرمینس پر متعلقہ متبادلوں پر مشتمل nsp7-11 پولی پروٹین تعمیرات کا ایک سیٹ E. coli میں تیار کیا گیا اور recombinant Mpro کے ساتھ کاٹا گیا۔چار سائٹس (بشمول این ایس پی 9 فلانکنگ سائٹ) کا پروٹولوٹک کلیویج کسی بھی متعارف کردہ متبادل (ایس آئی اپینڈکس، فگر ایس 9) سے نمایاں طور پر متاثر نہیں ہوتا ہے، ان پروٹینوں میں ساختی تبدیلیوں کو چھوڑ کر جو Mpro-ثالثی nsp8|9 کلیویج (یا دیگر) میں مداخلت کرتے ہیں۔ ویب سائٹ
Huh-7 خلیات کو جینوم کی لمبائی HCoV-229E RNA سے تبدیل کیا گیا، nsp9 N ٹرمینس پر محفوظ کردہ NNE ٹریپٹائڈس (N3825، N3826، اور E3827) میں Ala یا Ser کے متبادل کو انکوڈنگ کیا گیا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ زیادہ تر تغیرات مہلک ہیں۔ہم N-ٹرمینل Asn (N2835A یا N2835S) کے Ser یا Ala کی جگہ لے کر وائرس کو بچانے میں کامیاب رہے، لیکن NNE ترتیب (N3826A, N3826S, NN3825/6AA) میں دیگر سنگل اور ڈبل تغیرات کے ساتھ وائرس کو بحال کرنے میں ناکام رہے۔ NN3825/6SS) , E3827A) (شکل 5D)۔
یہ نتائج بتاتے ہیں کہ ٹشو کلچر میں کورونا وائرس کی نقل پر پابندی ہے (ایک جیسی یا ملتی جلتی)، جسم میں nsp9 NMPylation سائٹس کے قدرتی اتپریورتن کو محدود کرتی ہے، اور کورونا وائرس کے لائف سائیکل میں اس ردعمل کے کلیدی کردار کی حمایت کرتی ہے۔
تجربات کے آخری سیٹ میں، ہم نے C-ٹرمینل His6 کا لیبل لگا SARS-CoV-2 nsp12 اور nsp9، اور E. coli میں nsp12 کی دو اتپریورتی شکلیں تیار کیں۔NiRAN اور RdRp ڈومینز میں فعال سائٹ کی باقیات بالترتیب اس کے بجائے Ala کا استعمال کریں (شکل 6A اور SI اپینڈکس، ٹیبل S2)۔SARS-CoV-2 nsp12 میں K4465 HCoV-229E (SI اپینڈکس، فگر S2) میں K4135 سے مساوی ہے، جو ثابت ہوا کہ NiRAN سرگرمی اور HCoV-229E نقل (شکل 3D اور E) کے لیے ضروری ہے۔یہ باقیات شریان کے وائرس EAV nsp9 K94 باقیات سے بھی مطابقت رکھتی ہیں، جو پہلے NiRAN self-UMPylation/self-GMPylation (16) کے لیے ضروری دکھائی گئی تھی۔جیسا کہ شکل 6B میں دکھایا گیا ہے، SARS-CoV-2 nsp12 میں nsp9 کو بطور سبسٹریٹ استعمال کرتے ہوئے UMP منتقلی کی سرگرمی ہے، جبکہ nsp12_K4465A ایکٹو سائٹ میوٹینٹ غیر فعال ہے۔RdRp motif C کے SDD خصوصیت کی ترتیب میں دوہرا متبادل UMP منتقلی کی سرگرمی (شکل 6B) کو متاثر نہیں کرتا ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ nsp9 UMPylation میں RdRp سرگرمی کا کوئی براہ راست اثر نہیں ہوتا ہے۔اسی طرح کا ڈیٹا CTP، GTP اور ATP (SI اپینڈکس، Figure S10) کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیا گیا تھا۔خلاصہ طور پر، یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ NiRAN کی ثالثی nsp9 NMPylation کورونا وائرس میں قدامت پسندانہ سرگرمی رکھتی ہے جو آرتھوکورونا وائرس ذیلی فیملی کی مختلف نسل کی نمائندگی کرتی ہے۔
SARS-CoV-2 nsp12 ثالثی NMPylation of nsp9۔(A) Coomassie داغدار SDS-polyacrylamide جیل NMPylation ٹیسٹ میں استعمال ہونے والے ریکومبیننٹ پروٹین کو دکھاتا ہے۔کنٹرول کے طور پر، SARS-CoV-2 nsp12 کے NiRAN ڈومین (K4465A) اور RdRp ڈومین (DD5152/3AA) میں فعال سائٹ کے متبادل کے ساتھ ایک اتپریورتی پروٹین استعمال کیا گیا تھا۔ریزیڈیو نمبرنگ pp1ab میں پوزیشن پر مبنی ہے۔(B) nsp9-His6 اور [α-32P]UTP کو nsp12-His6 (جنگلی قسم [wt] اور اتپریورتی) کے سبسٹریٹ کے طور پر استعمال کرتے ہوئے UMPylation کا پتہ لگانے کا آٹوراڈیوگراف۔لیبل والے پروٹین کا مالیکیولر ماس (کلوڈالٹن میں) بائیں طرف دکھایا گیا ہے۔
NiRAN ڈومینز کو عام طور پر Nidovirales (16) میں محفوظ کیا جاتا ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ وہ Nidovirus کی نقل کے لیے ضروری انزیمیٹک رد عمل کو متحرک کرتے ہیں۔اس تحقیق میں، ہم یہ ثابت کرنے میں کامیاب رہے کہ کورونا وائرس کا نیران ڈومین NMP (NTP سے تیار کردہ) nsp9 کو منتقل کرتا ہے، جو کہ وائرس کی نقل میں شامل ایک پراسرار RNA بائنڈنگ پروٹین (26 ?? 29) ہے، تاکہ اسے قدرتی ہدف کے طور پر متعین کیا جا سکے۔ کورونا وائرس RTC کا پارٹنر۔
NiRAN ڈومین تین ترتیب شکلیں (AN، BN، اور CN) کا اشتراک کرتا ہے، جس میں بہت کم تعداد میں باقیات ہوتے ہیں جو monophyletic لیکن انتہائی امتیازی Nidovirales آرڈر میں تمام خاندانوں میں محفوظ ہوتے ہیں (8, 16)۔حالیہ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ وہ ساختی طور پر پروٹین کناز جیسے پروٹین کے بڑے پیمانے پر غیر مخصوص خاندان سے متعلق ہیں، جو اصل میں SelO خاندان کہلاتے تھے (17, 19, 22, 30, 31)۔SelO سے متعلق پروٹینوں میں کناز فولڈ ہوتے ہیں، لیکن کلاسیکی کنیز (22، 32) میں کئی محفوظ شدہ فعال سائٹ کی باقیات کی کمی ہوتی ہے۔فعال سائٹ پر پابند اور مخصوص تعاملات کے ذریعے مستحکم ہونے والے اے ٹی پی مالیکیولز کے الٹ واقفیت کی بنیاد پر، SelO کا قیاس کیا گیا اور بعد میں AMP (فاسفیٹ کی بجائے) کو پروٹین سبسٹریٹ (22) میں منتقل کرنے کی تصدیق کی گئی، جبکہ ایک اور بیکٹیریل SelO نما پروٹین YdiU ہے۔ حال ہی میں Tyr اور اس کے مختلف پروٹین ذیلی ذخائر (33) کے ساتھ UMP کے ہم آہنگی کے منسلک کو اتپریرک کرنے کے لئے دکھایا گیا ہے۔
کورونا وائرس NiRAN ڈومین کے پوٹیٹو ایکٹو سائٹ کے باقیات کی پیشین گوئی کی تصدیق اور توسیع کے لیے، ہم نے کورونا وائرس این ایس پی 12 (فگر 3D اور E اور SI اپینڈکس، شکل S3 اور ٹیبل) S1â پر میوٹیشن تجزیہ کرنے کے لیے بائیو کیمیکل اور ریورس جینیاتی طریقوں کا استعمال کیا۔ S4)۔اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ HCoV-229E K4135, R4178 اور D4280 کو Ala کے ساتھ تبدیل کرنے سے سیل کلچر میں وٹرو NMP ٹرانسفریج سرگرمی اور وائرس کی نقل کو ختم کر دیا جاتا ہے (شکل 3D اور E اور SI ضمیمہ، Figure S3)، NTP γ-phosphate میں ان کی موجودگی کی حمایت کرتا ہے۔ (K4135, R4178) اور ایکٹو سائٹ میٹل آئنوں کی کوآرڈینیشن (D4280)۔K4135 (17) پوزیشن کو مستحکم کرنے کی پیشن گوئی برڈز نیسٹ وائرس کی رینج میں محفوظ Glu کے E4145A متبادل کو وائرل نقل کو ختم کرنے کے لیے دکھایا گیا تھا، لیکن حیرت انگیز طور پر، ان وٹرو NMPylation پرکھ (شکل 3D اور E) میں سرگرمی کو برقرار رکھا گیا تھا۔ SI ضمیمہ، شکل S3 اور میزیں S1–S4)۔اسی طرح کا مشاہدہ اس وقت کیا گیا جب سالمونیلا ٹائفیموریم (E130A) (33) کے YdiU ہومولوگ میں اسی متبادل کو متعارف کرایا گیا تھا۔ایک ساتھ لے کر، یہ اعداد و شمار اتپریرک فنکشن کے بجائے اس محفوظ شدہ باقیات کے ریگولیٹری فنکشن کی حمایت کرتے ہیں۔
HCoV-229E NiRAN ڈومین (8) میں نیسٹو وائرس کی حد کے اندر محفوظ Phe ریزیڈیو (F4281A) کو تبدیل کرنے کے نتیجے میں وٹرو میں NMPylation سرگرمی میں کمی اور سیل کلچر میں وائرس کی نقل میں نمایاں کمی واقع ہوئی (شکل 3D, E اور SI) اپینڈکس، شکل S3)۔ڈیٹا اس باقیات کے اہم ریگولیٹری فنکشن کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے، جیسا کہ ہومولوجس DFG شکل Phe باقیات جو پہلے دکھایا گیا تھا۔کلاسیکی پروٹین کناسز میں، یہ Mg2+ بائنڈنگ لوپ کا حصہ ہے اور ریڑھ کی ہڈی کو جمع اور منظم کرنے میں مدد کرتا ہے؟??مؤثر اتپریرک سرگرمی کے لئے ضروری ہے (32، 34).K4116 باقیات (preAN شکل میں) کے لیے بالترتیب Ala اور Arg کو تبدیل کرنے سے، وائرل نقل کو ختم کر دیا گیا اور جیسا کہ توقع کی گئی ہے، متعارف کرائے گئے امینو ایسڈ سائیڈ چین پر منحصر ہے، وٹرو میں NMP ٹرانسفراز سرگرمی پر مختلف اثرات مرتب ہوئے (شکل 3D اور E اور SI ضمیمہ ، شکل S3)۔فنکشنل ڈیٹا ساختی معلومات کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ اس باقیات نے اے ٹی پی فاسفیٹ (17) کے ساتھ تعامل قائم کیا ہے۔دیگر نیسٹڈ وائرس فیملیز کے NiRAN ڈومین میں، HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 کی پوزیشن Lys, Arg یا His (8) کے قبضے میں ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ اس مخصوص باقیات کی فعال پابندی میں نرمی کی گئی ہے۔D4188A اور D4283A کا متبادل انزائم کی سرگرمی کو ختم کرتا ہے یا سختی سے کم کرتا ہے اور وائرس کی نقل کو ختم کرتا ہے (شکل 3)۔یہ دونوں باقیات زیادہ تر (لیکن تمام نہیں) نیسٹڈ وائرس (8) میں محفوظ ہیں، جو ایک اہم خاندانی مخصوص لیکن ممکنہ طور پر غیر اتپریرک فعل کی نشاندہی کرتی ہیں۔کئی دیگر Lys اور Asp باقیات (K4113A, D4180A, D4197A اور D4273A) کے Ala متبادل جو کہ کوروناویریڈی یا دیگر نیسٹیو ویریڈے خاندانوں میں محفوظ نہیں ہیں (8) کو بطور کنٹرول استعمال کیا گیا تھا۔جیسا کہ توقع کی گئی ہے، یہ متبادلات بڑی حد تک قابل برداشت ہیں، بعض صورتوں میں انزائم کی سرگرمی اور وائرل نقل میں معمولی کمی کے ساتھ (شکل 3 اور SI اپینڈکس، شکل S3)۔مجموعی طور پر، کورونا وائرس mutagenesis ڈیٹا EAV NiRAN-RdRp (16) کے خود GMP اور ریورس جینیٹکس ڈیٹا کے ساتھ بہت مطابقت رکھتا ہے، جس میں EAV nsp9 (کورونا وائرس nsp12 آرتھولوج) باقیات K94 (HCoV- 229E K4135 کے مطابق)، اہم افعال R124 (R4178 کے مطابق)، D132 (D4188 کے مطابق)، D165 (D4280 کے مطابق)، F166 (F4281 کے مطابق)۔مزید برآں، HCoV-229E mutagenesis ڈیٹا پہلے سے رپورٹ کردہ SARS-CoV ریورس جینیٹکس ڈیٹا (16) سے مطابقت رکھتا ہے اور اس میں توسیع کی گئی ہے، بالکل اسی طرح جو کہ متعلقہ CN موٹف Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 کے لیے مشاہدہ کیا گیا ہے۔ بیان کردہ فینوٹائپ -F219A اور HCoV-229E_F4281A (شکل 3 D اور E اور SI اپینڈکس، شکل S3 اور ٹیبل S1-S4)۔
EAV آرتھولوگس (16) کے مقابلے میں، جو UTP اور GTP کے لیے واضح ترجیح رکھتے ہیں (خود NMPylation رد عمل میں)، ہمارا مطالعہ ظاہر کرتا ہے کہ کورونا وائرس NiRAN ڈومین (جس کی نمائندگی HCoV-229E اور SARS-CoV-2 کے ذریعے کی جاتی ہے) مؤثر طریقے سے کر سکتے ہیں۔ تمام چار NMPs کو منتقل کر دیا گیا، حالانکہ UMP (اعداد و شمار 1 اور 3) کے لیے معمولی ترجیح ہے۔مخصوص NTP کو-سبسٹریٹ کی نسبتاً کم خصوصیت حال ہی میں رپورٹ کردہ SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 سپر کمپوزٹ ڈھانچے سے مطابقت رکھتی ہے، جس میں ADP-Mg2+ NiRAN کی فعال سائٹ سے منسلک ہوتا ہے، لیکن ایڈنائن پارٹ کے ساتھ نہیں۔ مخصوص تعاملات کی تشکیل (17)۔ہمارے مطالعے میں، NMPylation کے رد عمل میں استعمال ہونے والے نیوکلیوٹائڈ کی قسم کا اتپریورتی پروٹین (SI Appendix، Figure S3) کی سرگرمی پر کوئی فرق نہیں پڑتا ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ ان باقیات میں سے کوئی بھی مخصوص نیوکلیوبیس کے پابند ہونے سے قریبی تعلق نہیں رکھتا ہے۔کورونا وائرس اور آرٹیریل وائرس کے نیران ڈومینز میں مشاہدہ کردہ مختلف NTP کو-سبسٹریٹ ترجیحات کی ساختی بنیاد اور ممکنہ حیاتیاتی اہمیت کا مطالعہ کرنا باقی ہے۔وہ درست ہو سکتے ہیں یا ان کے متعلقہ مطالعات کی حدود کی وجہ سے ہو سکتے ہیں۔فی الحال، اس بات کو مسترد نہیں کیا جا سکتا کہ شریانوں کے وائرس NiRAN ڈومین کی ممکنہ NMPylator سرگرمی (پہلے خصوصیت والی سیلف NMPylation سرگرمی کے مقابلے) مختلف کو-سبسٹریٹ ترجیح رکھتی ہے، اس بات کو مدنظر رکھتے ہوئے کہ شریان اور کورونا وائرس کے درمیان مماثلت ہے۔ NiRAN ڈومین اپنی حد پر ہے۔ترتیب پر مبنی موازنہ (16)۔pseudokinase SelO کے مقابلے میں، جو Mg2+ کو کوفیکٹر کے طور پر استعمال کرتا ہے، کورونا وائرس اور آرٹیریل وائرس NiRAN کی سرگرمی Mn2+ (16) (شکل 3C اور SI اپینڈکس، شکل S1) پر منحصر ہے۔Mn2+ انحصار اور UTP کے لیے واضح ترجیح پروٹین NMPylators کی ایک غیر معمولی خصوصیت ہے، اور حال ہی میں سالمونیلا ٹائفیموریم کے YdiU پروٹین میں اس کی تصدیق ہوئی ہے، جو خلیات کو تناؤ سے بچانے کے لیے Mn2+ پر منحصر پروٹین چیپیرون UMPylation کو متحرک کرتا ہے۔ 33)۔
کورونا وائرس NiRAN ڈومین اور سیلولر پروٹین کنیز (17, 19) کے درمیان حال ہی میں بیان کردہ ساختی مماثلت NiRAN کی NMP کو ہم آہنگی کے ساتھ دوسرے پروٹینوں سے جوڑنے کی صلاحیت کے لیے اضافی مدد فراہم کرتی ہے جس کی ہم نے اس تحقیق میں اطلاع دی ہے۔ہم نے اپنے ممکنہ NiRAN اہداف کی تلاش کو HCoV-229E ORF1a کے ذریعے انکوڈ شدہ پروٹینز پر مرکوز کیا، جو کہ براہ راست یا بالواسطہ طور پر RTC کے ORF1b-انکوڈ شدہ نقل (12، 35) کی مدد کے لیے جانا جاتا ہے۔ہمارے تجربات nsp9 (شکل 2) کے موثر اور مخصوص NMPylation کے لیے حتمی ثبوت فراہم کرتے ہیں۔اگر ٹارگٹ پروٹین کو ایک داڑھ کی زیادتی میں استعمال کیا جاتا ہے جو اینزائم (nsp12) سے 8 سے 10 گنا زیادہ ہے، تو اس بات کی تصدیق ہوتی ہے کہ nsp9 مکمل طور پر (mono) NMPized ہے (شکل 4)۔ہم نے یہ نتیجہ اخذ کیا کہ nsp12 اور nsp9 کے درمیان تعامل قلیل المدتی ہے اور یہ nsp9 کے ساتھ ایک مستحکم کمپلیکس نہیں بنائے گا (دیگر RTC ذیلی یونٹوں کی عدم موجودگی میں)۔اس نتیجے کی تائید SARS-CoV پروٹوم (35) پر پروٹین کے تعامل کے مطالعے سے ہوتی ہے۔MS تجزیہ نے nsp9 کے N-ٹرمینل باقیات کے بنیادی امائن کو NMPylation سائٹ (SI اپینڈکس، Figure S5) کے طور پر شناخت کیا۔فاسفورامیڈیٹ بانڈ اور این ٹرمینل امینو گروپ کی تشکیل NiRAN کی ثالثی NMPylation سرگرمی کو Pseudomonas syringae SelO-mediated AMPylation رد عمل سے ممتاز کرتی ہے، جو Ser، Thr، یا Tyr کی باقیات میں O-linked AMP کی تشکیل کو اتپریرک کرتی ہے۔ 22)، اور S. typhimurium YdiU O-linked (Tyr کے ساتھ) اور N-linked (اس کے ساتھ) پیپٹائڈ-UMP ایڈکٹ بناتا ہے۔پروٹینز کے SelO خاندان کے بارے میں دستیاب محدود معلومات اس بات کی نشاندہی کرتی ہیں کہ اس بڑے پروٹین خاندان کے افراد پیپٹائڈ-NMP ایڈیکٹس کی تشکیل میں بہت مختلف ہیں۔یہ ایک دلچسپ مشاہدہ ہے جو مزید مطالعہ کا مستحق ہے۔
اس مطالعہ میں حاصل کردہ اعداد و شمار نے ہمیں یہ قیاس کرنے پر مجبور کیا کہ nsp9 کے NMPylation کو مفت N-ٹرمینس کی ضرورت ہے۔وائرل ریپلیکیشن کے تناظر میں، یہ nsp8|nsp9 پروسیسنگ سائٹ کے پروٹولائٹک کلیویج کے ذریعے فراہم کیا جائے گا جس میں Mpro اور pp1ab کے ذریعے ثالثی پولی پروٹین pp1a ہے۔زیادہ تر کورونا وائرسز میں، اس مخصوص سائٹ (VKLQ|NNEI in HCoV-229E) اور دیگر تمام کورونا وائرس Mpro کلیویج سائٹس کے درمیان فرق Asn ہے (بلکہ ایک اور چھوٹی باقیات، جیسے Ala، Ser یا Gly) P1â پر قبضہ کرتی ہے؟??مقام (36)۔ابتدائی مطالعات میں حاصل کردہ پیپٹائڈ کلیویج ڈیٹا سے پتہ چلتا ہے کہ nsp8|nsp9 سائٹ کی کلیویج کی کارکردگی دوسری سائٹوں کے مقابلے میں کم تھی، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ 1) سی ٹرمینل کی بروقت مربوط پروسیسنگ میں اس مخصوص سائٹ کا ایک ریگولیٹری کردار ہو سکتا ہے۔ pp1a خطہ، یا 2) وائرس کی نقل میں خصوصی محفوظ nsp9 N-terminus کا کردار (37)۔ہمارے اعداد و شمار (شکل 5A) سے پتہ چلتا ہے کہ حقیقی N-ٹرمینل ترتیب کو لے جانے والے nsp9 کی دوبارہ پیدا ہونے والی شکل کو nsp12 کے ذریعہ مؤثر طریقے سے NMPائز کیا گیا تھا۔N-ٹرمینل فلانکنگ سیکوئنس کو فیکٹر Xa (nsp9-His6؛ SI اپینڈکس، ٹیبل S1) یا Mpro-ثالثی کلیویج (nsp7-11-His6؛ شکل 5A اور SI اپینڈکس، ٹیبل S1) کے ذریعے ہٹا دیا گیا تھا۔اہم بات یہ ہے کہ غیر کٹے ہوئے nsp9 پر مشتمل پیشگی nsp7-11-His6 نے nsp12 کے NMPylation کے خلاف مزاحمت ظاہر کی، جو ہمارے ڈیٹا سے مطابقت رکھتا ہے، اس بات کا اشارہ ہے کہ nsp9-NMP نشہ N-ٹرمینل پرائمری امائن (SI اپینڈکس، فگر S5) کے ذریعے بنتا ہے۔ .NiRAN سبسٹریٹ کی خصوصیت کی گہری سمجھ حاصل کرنے کے لیے، ہم نے پھر nsp9 کے ملحقہ N-ٹرمینل باقیات پر توجہ مرکوز کی۔دیگر پروٹینوں کی عدم موجودگی میں، وہ ساختی طور پر لچکدار ہوتے ہیں، جو انہیں nsp9 (26 28، 38) کی غیر لیبل والی شکل میں دریافت ہونے سے روکتے ہیں، جو ان کے محدود فطری تغیر کی نشاندہی کرتے ہیں یہ اہم ترتیب سے متعلق مخصوص (ثانوی ساخت سے متعلق نہیں) کی وجہ سے ہے۔ این ایس پی 9 این ٹرمینل فریگمنٹ کا فنکشن۔اس خطے میں محفوظ شدہ اوشیشوں کے Ala متبادل (اعداد و شمار 5C اور D اور SI ضمیمہ، شکل S8) سے پتہ چلتا ہے کہ N3826 وٹرو میں nsp9 NMPylation کے لیے ضروری ہے، جبکہ N3825A اور E3827A متبادل NMPylation میں کمی کا باعث بنتے ہیں، جبکہ P3820 ذیلی P3825 نہیں کرتے۔ .ظاہر ہے nsp9 NMPylation کو متاثر کرتا ہے۔اگرچہ N-ٹرمینل Asn (N3825A, N3825S) کے متبادل کا nsp9 NMPylation اور سیل کلچر (شکل 5C اور D) میں وائرس کی نقل پر صرف ایک اعتدال پسند اثر پڑتا ہے، N-ٹرمینل 3825-NN dipe سے Asn کی باقیات کی ترتیب کو حذف کرنا۔ ثابت ہوا کہ یہ وائرسوں کے لیے مہلک ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ N-ٹرمینس پر ایک اور باقیات سے پہلے Asn کی ایک باقیات کی ضرورت ہوتی ہے، ترجیحا Asn، حالانکہ ایسا لگتا ہے کہ اسی طرح کی باقیات کی متبادل کو جزوی طور پر برداشت کیا جا سکتا ہے (شکل 5B، C، اور D)۔ہم یہ نتیجہ اخذ کرتے ہیں کہ 3825-NN ڈائیپٹائڈ، خاص طور پر کورونا وائرس رینج کے اندر محفوظ اور ضروری N3826 باقیات (SI اپینڈکس، Figure S6)، NiRAN کی فعال سائٹ میں nsp9 N-ٹرمینس کی درست پابندی اور واقفیت کو یقینی بناتا ہے۔
تمام ذیلی فیملیز کے محفوظ Glu کے لیے Ala (E3827A) کو تبدیل کرنا وٹرو میں nsp9 NMPylation کو برقرار رکھتا ہے لیکن سیل کلچر (شکل 5C اور D) میں وائرس کے لیے مہلک ہے، جو اس باقیات کے اضافی کام کی نشاندہی کرتا ہے، مثال کے طور پر، کلیدی تعاملات میں (NMPylated یا غیر ترمیم شدہ) ) nsp9 N-terminus اور وائرس کی نقل میں ملوث دیگر عوامل۔Nsp9 اتپریورتنوں نے nsp9 یا کسی ملحقہ nsps (39) (SI اپینڈکس، Figure S9) کے پروٹولوٹک عمل کو متاثر نہیں کیا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ مشاہدہ کیے گئے متعدد nsp9 اتپریورتنوں کی مہلک فینوٹائپس C پروٹولیٹک عمل-ٹرمینل pp1a ایریا کی بے ضابطگی کی وجہ سے نہیں ہوئی تھیں۔ .
مندرجہ بالا اعداد و شمار اس بات کا ثبوت فراہم کرتے ہیں کہ pp1a/pp1ab میں nsp8|9 کلیویج سائٹ کے Mpro-ثالثی کے علاج کے بعد، nsp9 کے N-ٹرمنس کو UMPylated (یا کسی اور NMP کے ساتھ جزوی طور پر تبدیل کیا جا سکتا ہے)۔اس کے علاوہ، این ایس پی 9 کے این ٹرمینس کا بہترین تحفظ (بشمول کورونا وائرس فیملی میں واحد اور غیر متزلزل Asn باقیات) اور اس مطالعہ میں حاصل کردہ معکوس جینیاتی ڈیٹا (اعداد و شمار 3E اور 5D) نے ہمیں اس نتیجے پر پہنچایا کہ بیان کردہ nsp9 NMPylation۔ حیاتیاتی طور پر متعلقہ اور کورونا وائرس کی نقل کے لیے ضروری ہے۔اس ترمیم کے عملی نتائج کا مطالعہ کرنا باقی ہے، مثال کے طور پر، پہلے بیان کردہ (غیر مخصوص) nsp9 (غیر ترمیم شدہ شکل) RNA بائنڈنگ سرگرمی (2628) کے حوالے سے۔N-ٹرمینل NMPylation پروٹین یا RNA سبسٹریٹس کے ساتھ nsp9 کے تعامل یا مختلف چار سطحی اسمبلیوں کی تشکیل کو بھی متاثر کر سکتا ہے۔ان کا مشاہدہ ساختی مطالعات میں کیا گیا ہے اور اس بات کی تصدیق کی گئی ہے کہ ان کا عملی طور پر کورونا وائرس کی نقل سے تعلق ہے، حالانکہ خاص طور پر اس ترمیم کی صورت میں (26- ââ29، 40) کی عدم موجودگی میں۔
اگرچہ کورونا وائرس NiRAN ڈومین کی ہدف کی خصوصیت کو ابھی بھی مزید تفصیل سے بیان کرنے کی ضرورت ہے، ہمارے ڈیٹا سے پتہ چلتا ہے کہ کورونا وائرس NiRAN ڈومین کی پروٹین ہدف کی خصوصیت بہت تنگ ہے۔اگرچہ تمام nidovirus خاندانوں کے NiRAN ڈومین میں کلیدی فعال سائٹ کی باقیات (8, 16) کا تحفظ ان پروٹینوں کے محفوظ NMPylator کی سرگرمی کی بھرپور حمایت کرتا ہے، لیکن اس ڈومین کے ذیلی بائنڈنگ پاکٹ اوشیشوں کی شناخت تحفظ اور تحفظ کو نمایاں کرنا باقی ہے۔ ، اور Nidovirales مقاصد کے مختلف خاندانوں کے درمیان مختلف ہو سکتے ہیں۔اسی طرح، دیگر نیسٹڈ وائرسز کے متعلقہ اہداف کا تعین ہونا باقی ہے۔وہ nsp9 یا دوسرے پروٹین کے ریموٹ آرتھولوگ ہو سکتے ہیں، کیونکہ پانچ ریپلیکس ڈومینز کے باہر کی ترتیبیں جو عام طور پر نیسٹڈ وائرسز میں محفوظ ہوتی ہیں کم محفوظ ہوتی ہیں (8)، بشمول Mpro اور NiRAN کے درمیان جینوم سرنی، ان میں، nsp9 واقع ہے کورونا وائرس.
اس کے علاوہ، ہم فی الحال اس امکان کو رد نہیں کر سکتے کہ NiRAN ڈومین کے اضافی (بشمول سیلولر) اہداف ہیں۔اس معاملے میں، یہ بات قابل ذکر ہے کہ اس ابھرتے ہوئے پروٹین NMPylators (NMPylators) (30، 31) میں بیکٹیریل ہومولوگس "ماسٹر ریگولیٹرز" لگتے ہیں؟NMP مختلف قسم کے سیلولر پروٹینوں کو ان کی بہاو کی سرگرمیوں کو منظم کرنے یا ختم کرنے کے لیے ماڈیول کرتا ہے، اس طرح مختلف قسم کے حیاتیاتی عمل میں کردار ادا کرتا ہے، جیسے سیلولر تناؤ کا ردعمل اور ریڈوکس ہومیوسٹاسس (22، 33)۔
اس مطالعے میں (اعداد و شمار 2 اور 4 اور SI ضمیمہ، اعداد و شمار S3 اور S5)، ہم یہ ثابت کرنے میں کامیاب رہے کہ nsp12 نے UMP (NMP) حصے کو nsp9 میں ایک (محفوظ) پوزیشن میں منتقل کیا، جبکہ دیگر پروٹینوں میں ترمیم نہیں کی گئی۔ شرائط کے تحت استعمال کیا جاتا ہے، اچھی طرح سے بیان کردہ (ڈھیلے کے بجائے) سبسٹریٹ کی خصوصیت کی حمایت کی جاتی ہے۔اس سے مطابقت رکھتے ہوئے، N-ٹرمینل nsp9 NMPylation کے مقابلے میں، nsp12 کی اپنی NMPylation سرگرمی بہت کم ہے، اس کی کھوج کے لیے آٹوراڈیوگرافی کی نمائش کے لیے طویل وقت درکار ہوتا ہے، اور nsp12 کے ارتکاز میں 10 گنا اضافہ استعمال کیا جاتا ہے۔اس کے علاوہ، ہمارا MS تجزیہ nsp12 کے NMPylation کے ثبوت فراہم کرنے میں ناکام رہا، جس سے پتہ چلتا ہے کہ NiRAN ڈومین سیلف NMPylation (بہترین طور پر) ایک ثانوی سرگرمی ہے۔تاہم، یہ غور کرنا چاہئے کہ دیگر مطالعات نے ابتدائی ثبوت فراہم کیے ہیں کہ بیکٹیریل NMPylator کی خود AMPylation کی حیثیت دیگر پروٹین ذیلی ذخیروں پر ان کی NMPylation سرگرمی کو کنٹرول کرسکتی ہے (22، 33)۔لہذا، EAV nsp9 (16) اور کورونا وائرس nsp12 (اس مطالعہ) کے لیے رپورٹ کردہ خود NMPylation سرگرمیوں کے ممکنہ فعال اثرات کی تحقیقات کے لیے مزید تحقیق کی ضرورت ہے، بشمول C-ٹرمینل RdRp ڈومین کی تہہ پر مجوزہ چیپیرون جیسا اثر ( 16))۔
اس سے پہلے، nidoviral NiRAN ڈومین کے ممکنہ بہاو افعال کے بارے میں کئی مفروضوں پر غور کیا گیا ہے، بشمول RNA ligase، RNA-capped guanylate transferase اور protein priming activity (16)، لیکن ان میں سے کوئی بھی دستیاب بہاو افعال کے ساتھ مطابقت نہیں رکھتا ہے۔مندرجہ ذیل پوزیشنوں میں حاصل کردہ معلومات بغیر کسی اضافی مفروضے کے بالکل اسی وقت ہے۔اس مطالعے میں حاصل کردہ ڈیٹا سب سے زیادہ مطابقت رکھتا ہے (لیکن یہ ثابت نہیں کر سکتا) کہ NiRAN ڈومین پروٹین کی حوصلہ افزائی RNA کی ترکیب کے آغاز میں ملوث ہے۔پہلے یہ خیال کیا جاتا تھا کہ نیران ڈومین کا کام 5??²-RNA کیپنگ یا RNA ligation کے رد عمل ان اور دیگر ڈیٹا کی حمایت سے متاثر نہیں ہوتے ہیں۔لہذا، مثال کے طور پر، NiRAN کی فعال سائٹ کو محفوظ شدہ Asp کو عام بنیاد کے طور پر شامل سمجھا جاتا ہے (Pseudomonas syringae SelO میں D252؛ HCoV-229E pp1ab میں D4271؛ SARS-CoV-2 nsp12 میں D208) (SI ضمیمہ، شکل 2) )۔S2) (17, 22, 33)، جبکہ اے ٹی پی پر منحصر آر این اے لیگیس اور آر این اے کیپنگ انزائم میں کیٹالیسس کوولنٹ انزائم-(لائسیل-این) این ایم پی انٹرمیڈیٹ کے ذریعے انجام دیا جاتا ہے، جس میں ایک غیر تبدیل شدہ لائس باقیات شامل ہوتے ہیں۔ 41)۔اس کے علاوہ، محفوظ پروٹین کے اہداف کے لیے کورونا وائرس NiRAN کی نمایاں ترتیب پر مبنی خصوصیت اور NTP کو-سبسٹریٹس (UTP کو ترجیح دیتا ہے) کے لیے آرام دہ خصوصیت NiRAN-ثالثی کیپنگ انزائم یا RNA ligase جیسے افعال کی مخالفت کرتی ہے۔
ظاہر ہے، توثیق کرنے کے لیے بہت زیادہ اضافی کام کی ضرورت ہے اور، اگر ثابت ہو جائے تو، پروٹین سے متاثرہ آر این اے کی ترکیب میں nsp9-UMP (nsp9-NMP) کے ممکنہ کردار کے بارے میں وضاحت کریں، جو کئی دلچسپ لیکن (اب تک) پہلے رپورٹ کی گئی رپورٹوں کو جوڑ دے گا۔ .الگ تھلگ مشاہدات۔مثال کے طور پر، یہ طے کیا گیا ہے کہ کورونا وائرس کے منفی اسٹرینڈ RNA کا اختتام اولیگو (U) اسٹرینڈ (42, 43) سے شروع ہوتا ہے۔یہ مشاہدہ اس خیال سے مطابقت رکھتا ہے کہ منفی اسٹرینڈ RNA کی ترکیب کا آغاز nsp9 کی UMPylated شکل کو پولی(A) ٹیل (ٹرگرز) سے باندھ کر کیا جاتا ہے، جسے اس کے RNA بائنڈنگ کے ذریعے فروغ دیا جا سکتا ہے سرگرمی اور/یا تعامل ایک اور RTC پروٹین۔nsp9 کی طرف سے فراہم کردہ UMP حصہ پھر nsp7/8/nsp12-ثالثی oligouridylation کے لیے "پرائمر" کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے، جینومک RNA میں 3??²-poly(A) دم یا ایک اور oligo (A) پر مشتمل ترتیب کا استعمال کرتے ہوئے ایک ٹیمپلیٹ کے طور پر کام کرتا ہے، جیسا کہ picornavirus VPg پروٹین (44) کے لیے قائم کردہ طریقہ کار کی طرح ہے۔اگر تجویز "غیر معیاری" ہو تو کیا ہوگا؟???(پروٹین سے متاثرہ) منفی اسٹرینڈ آر این اے کی ترکیب کا آغاز مشاہدات کو ایک لنک فراہم کرتا ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ کورونا وائرس منفی اسٹرینڈ آر این اے کے آخر میں UMP (UTP کی بجائے) ہے (42)، جو اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ نیوکلک ایسڈ ڈائسر نامعلوم uridine-specific endonuclease کے ذریعے فاسفوریلیٹ کے سرے کو صاف کرتا ہے۔اگر تصدیق ہو جائے تو یہ نیوکلک ایسڈ ہائیڈرولائٹک سرگرمی nsp9 کی اولیگومرک UMPylated شکل کو نوزائیدہ منفی اسٹرینڈ کے 5 ² سرے سے جاری کرنے میں مدد کر سکتی ہے۔پروٹین پرائمنگ میں nsp9 کا ممکنہ کردار پچھلے ریورس جینیٹکس اسٹڈیز کے ساتھ بھی مطابقت رکھتا ہے، جس نے یہ ظاہر کیا ہے کہ nsp9 (اور nsp8) کورونا وائرس جینوم کے 3 سرے کے قریب محفوظ cis- ایکٹنگ RNA عنصر کے ساتھ تنقیدی اور خاص طور پر تعامل کرتے ہیں۔45)۔اس رپورٹ کے مطابق اب ان سابقہ مشاہدات کا دوبارہ جائزہ لیا جا سکتا ہے اور مزید تحقیق کے ذریعے اس میں توسیع کی جا سکتی ہے۔
خلاصہ طور پر، ہمارے ڈیٹا نے N-ٹرمینس پر RdRp سے منسلک ملکیتی نیسٹڈ وائرس انزائم ٹیگ کی مخصوص سرگرمی کا تعین کیا۔کورونا وائرس میں، اس نئی دریافت شدہ NiRAN کی ثالثی UMPylator/NMPylator سرگرمی کا استعمال Mn2+ اور ملحقہ Asn کی باقیات پر انحصار کرنے اور N-ٹرمینل پرائمری امائن کے ساتھ (کم توانائی والے) فاسفورامیڈیٹ بانڈز کی تشکیل کا سبب بنتا ہے۔این ایس پی 8nsp12 NiRAN ایکٹو سائٹ اور nsp9 ٹارگٹ میں کلیدی باقیات کا تحفظ، SARS-CoV-2 سمیت دو کورونا وائرس سے حاصل کردہ ڈیٹا کے ساتھ مل کر، اس بات کا پختہ ثبوت فراہم کرتا ہے کہ nsp9 NMPylation ایک کورونا وائرس ہے قدامت پسند خصوصیات بھی وائرس کی نقل میں ایک اہم قدم ہیں۔دستیاب اعداد و شمار ہمیں اس نتیجے پر پہنچاتے ہیں کہ پروٹین سے متاثرہ آر این اے کی ترکیب میں این ایس پی 9 کی NMPylated شکل کا مخصوص کردار کورونا وائرس اور دیگر نیسٹڈ وائرسز کے لیے ایک معقول منظر نامہ ہے، اور NiRAN دیگر نامعلوم پروٹینوں کو بھی نشانہ بنا سکتا ہے۔وائرس کو منظم کریں۔میزبان تعامل۔اگر تصدیق ہو جاتی ہے تو وائرل RNA کی ترکیب میں پروٹین پرائمر کی شمولیت Mpro/3CLpro اور RdRp ڈومینز کے پہلے سے پائے جانے والے کورونا وائرس اور picornavirus نما سپر گروپ (9) کے درمیان تسلسل سے تعلق کو بڑھا دے گی، جو اب حال ہی میں قائم Pisonivirites میں متحد ہو چکے ہیں۔ 46) زمرے میں۔
ہمارا ڈیٹا یہ بھی ظاہر کرتا ہے کہ اس مطالعے میں شناخت شدہ بنیادی، منتخب اور قدامت پسند انزائم سرگرمیوں کو اینٹی وائرل ادویات کے اہداف کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔وہ مرکبات جو NiRAN کی فعال سائٹ میں محفوظ nsp9 N-terminus کے پابند ہونے (اور بعد میں ترمیم) میں مداخلت کرتے ہیں ان کو موثر اور ورسٹائل اینٹی وائرل ادویات میں تیار کیا جا سکتا ہے، جو مختلف (ذیلی) جینس انفیکشنز سے جانوروں اور انسانی کورونا وائرس کے علاج کے لیے موزوں ہے۔ بشمول SARS-CoV-2 اور مڈل ایسٹ ریسپریٹری سنڈروم کورونا وائرس۔
اس مطالعے میں تیار کردہ کورونا وائرس پروٹین کی کوڈنگ ترتیب کو RT-PCR کے ذریعے بڑھایا گیا RNA کا استعمال کرتے ہوئے HCoV-229E سے متاثرہ Huh-7 سے الگ تھلگ یا SARS-CoV-2 سے متاثرہ Vero E6، اور معیاری کلوننگ کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے داخل کیا گیا۔pMAL-c2 (نیو انگلینڈ بائیولوجیکل لیبارٹری) یا PASK3-Ub-CHis6 (47) اظہار ویکٹر (SI ضمیمہ، میزیں S1 اور S2)۔سنگل کوڈن متبادل پی سی آر پر مبنی سائٹ ڈائریکٹڈ میوٹیجینیسیس (48) کے ذریعہ متعارف کرایا گیا تھا۔MBP فیوژن پروٹین تیار کرنے کے لیے، E. coli TB1 خلیات کو مناسب pMAL-c2 پلاسمڈ کنسٹرکٹ (SI اپینڈکس، ٹیبل S1) کے ساتھ تبدیل کیا گیا۔فیوژن پروٹین کو امیلوز وابستگی کرومیٹوگرافی کے ذریعہ پاک کیا گیا تھا اور فیکٹر Xa سے صاف کیا گیا تھا۔اس کے بعد، C-ٹرمینل His6-tagged پروٹین کو Ni-immobilized Metal affinity chromatography (Ni-IMAC) کے ذریعے پاک کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے (49)۔ubiquitin فیوژن پروٹین تیار کرنے کے لیے، E. coli TB1 خلیات نے مناسب paSK3-Ub-CHis6 پلاسمڈ کنسٹرکٹ (SI اپینڈکس، ٹیبلز S1 اور S2) اور pCGI پلاسمڈ DNA انکوڈنگ ubiquitin-specific C-terminal hydrolase 1 (Ubp1) کا استعمال کیا۔تبدیلی (47)۔C-ٹرمینل His6-tagged کورونا وائرس پروٹین کو صاف کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (50)۔
HCoV-229E nsp12-His6 کا خود NMPylation ٹیسٹ کیا گیا جیسا کہ EAV nsp9 (16) میں بیان کیا گیا ہے۔مختصراً، nsp12-His6 (0.5 µM) میں 50 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH، pH 8.0، 5 mM dithiothreitol (DTT)، 6 mM MnCl2، buffate، 25mm مخصوص NTP اور 0.17 µM ملاپ [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) 30 °C پر 30 منٹ کے لیے۔nsp12-ثالثی nsp9 NMPylation کے دیگر تمام (معیاری) NMPylation اسسیس میں، رد عمل کی شرائط کو اس طرح ایڈجسٹ کیا جاتا ہے: nsp12-His6 (0.05 µM) اور nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH (pH08) کی موجودگی میں۔ )، 5 mM DTT، 1 mM MnCl2، 25 µM اشارہ کردہ NTP، اور 0.17 µM مماثل [α32-P]NTP۔30 ° C پر 10 منٹ تک انکیوبیٹ کرنے کے بعد، رد عمل کا نمونہ SDS-PAGE نمونے کے بفر کے ساتھ ملایا گیا: 62.5 mM tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl (pH 6.8)، 100 mM DTT، 2.5% SDS، 10% glycerol اور %0.0mophenol. نیلاپروٹین کو 5 منٹ کے لیے 90 ° C پر گرم کرکے اور 12% SDS-PAGE سے الگ کر دیا گیا۔جیل Coomassie Brilliant Blue محلول (40% methanol، 10% acetic acid، 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250) کے ساتھ فکسڈ اور داغ دار ہے، رنگین، اور 20 گھنٹے تک فاسفورسنٹ امیجنگ اسکرین کے سامنے (NMPy سے nsp12 کا پتہ لگانے کے لیے) یا (زیادہ سے زیادہ) 2 گھنٹے (nsp9 NMPylation کا اندازہ لگانے کے لیے)۔اسکرین کو اسکین کرنے کے لیے ٹائفون 9200 امیجر (جی ای ہیلتھ کیئر) استعمال کیا گیا اور امیج جے سگنل کی شدت کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا۔
MS تجزیہ کے لیے، 1 µM nsp12-His6 اور 10 µM nsp9 (بغیر ہیکسہسٹیڈائن ٹیگ) NMPylation تجزیہ (SI اپینڈکس، ٹیبل S1) میں استعمال کیے گئے اور 500 µM UTP اور GTP کی بڑھتی ہوئی ارتکاز کو استعمال کیا گیا۔ان کے ارتکاز اور متوقع پروٹین کے معیار پر منحصر ہے، MassPrep کالم (Waters) سے لیس ایک Waters ACQUITY H-Class HPLC سسٹم 1 سے 10 µL بفرڈ پروٹین سلوشنز کو آن لائن ڈیسالٹ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ڈیسالٹ شدہ پروٹین کو Synapt G2Si ماس اسپیکٹومیٹر (واٹر) کے الیکٹرو اسپرے آئن سورس میں بفر A (water/0.05% formic acid) اور بفر B (acetonitrile/0.045% formic acid) کے درج ذیل گریڈینٹ کے ذریعے نکالا جاتا ہے، اور کالم کا درجہ حرارت ہوتا ہے۔ 60 ° C اور بہاؤ کی شرح 0.1 ملی لیٹر/منٹ: 2 منٹ کے لیے 5% A کے ساتھ اخراج، پھر 8 منٹ کے اندر 95% B پر ایک لکیری میلان، اور مزید 4 منٹ کے لیے 95% B کو برقرار رکھیں۔
500 سے 5000 m/z کی وسیع رینج کے ساتھ مثبت آئنوں کا پتہ چلا ہے۔Glu-fibrinopeptide B کی پیمائش ہر 45 سیکنڈ میں خودکار بڑے پیمانے پر بڑھے ہوئے اصلاح کے لیے کی جاتی ہے۔MaxEnt1 ایکسٹینشن کے ساتھ MassLynx انسٹرومنٹ سافٹ ویئر استعمال کریں تاکہ بیس لائن کو کم کرنے اور ہموار کرنے کے بعد اوسط سپیکٹرم کو ڈی کنووول کریں۔
UMPylated HCoV-229E nsp9 کو ترتیب دینے والے گریڈ میں ترمیم شدہ ٹرپسن (Serva) کو شامل کرکے ہضم کیا گیا اور رات بھر 37 ° C پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ایک Chromabond C18WP اسپن کالم (حصہ نمبر 730522؛ Macherey-Nagel) پیپٹائڈس کو صاف کرنے اور مرتکز کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا تھا۔آخر میں، پیپٹائڈ کو 25 µL پانی میں تحلیل کیا گیا، جس میں 5% acetonitrile اور 0.1% فارمک ایسڈ تھا۔
نمونوں کا تجزیہ MS نے Orbitrap Velos Pro ماس سپیکٹرومیٹر (تھرمو سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے کیا۔حتمی nanoâ HPLC سسٹم (Dionex)، 50 سینٹی میٹر کسٹم اینڈ ماونٹڈ سے لیس؟2.4 μm مقناطیسی موتیوں سے بھرا ہوا 75 μm C18 RP کالم (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Proxeon nanospray سورس کے ذریعے آن لائن ماس سپیکٹرو میٹر سے جڑیں۔300 µm اندرونی قطر ×??1 سینٹی میٹر C18 پیپ میپ پری کنسنٹریشن کالم (تھرمو سائنٹیفک)۔پانی/0.05% فارمک ایسڈ کو سالوینٹس کے طور پر استعمال کرتے ہوئے، نمونہ خود بخود پھنس گیا اور 6 µL/منٹ کی بہاؤ کی شرح سے صاف ہو گیا۔
پانی/0.05% فارمک ایسڈ (سالوینٹ A) اور 80% acetonitrile/0.045% فارمک ایسڈ (سالوینٹ B) کے درج ذیل گریڈینٹ کو 300 nL/منٹ کی بہاؤ کی شرح پر ٹرپٹک پیپٹائڈس کی علیحدگی حاصل کرنے کے لیے استعمال کیا گیا: 4% B 5 منٹ، پھر 30 A لکیری گریڈینٹ منٹوں میں 45% B تک، اور 5 منٹ کے اندر اندر 95% سالوینٹ B تک لکیری اضافہ۔کرومیٹوگرافک کالم کو ایک سٹینلیس سٹیل نینو ایمیٹر (Proxeon) سے جوڑیں، اور 2,300 V کی صلاحیت کا استعمال کرتے ہوئے ماس سپیکٹرو میٹر کے گرم کیپلیری پر ایلیونٹ کو براہ راست چھڑکیں۔ کم از کم تین ڈیٹا MS/MS اسکینوں کے ساتھ، 30 سیکنڈ کے لیے متحرک طور پر خارج کر دیا گیا، لکیری آئن ٹریپ کولیژن انڈس ڈسوسی ایشن کا استعمال کرتے ہوئے یا آربٹریپ ڈٹیکشن کے ساتھ مل کر زیادہ توانائی کے تصادم کی تقسیم، ریزولوشن 7,500 ہے۔
پوسٹ ٹائم: اگست 03-2021